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May 09, 2023

微好気条件下における黄色ブドウ球菌の能力の複雑な制御

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 512 (2023) この記事を引用

399 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

3 つの主要な遺伝子水平伝達機構の 1 つである自然形質転換を実行するには、細菌は遺伝的能力と呼ばれる生理学的に分化した状態に入る必要があります。 興味深いことに、そのような適性を示す新しい細菌は頻繁に発見されており、最新のものの 1 つはヒトの病原体である黄色ブドウ球菌です。

ここでは、浮遊細胞培養に基づいて、集団の大部分が能力開発を活性化し、黄色ブドウ球菌の自然な形質転換効率を大幅に改善する最適化されたプロトコルを示します。 これらの条件を利用して、トランスクリプトミクス解析を実行して、各中枢能力制御因子のレギュロンを特徴付けます。 SigH と ComK1 は両方とも、天然の形質転換遺伝子の活性化に必須であるだけでなく、末梢機能の活性化または抑制にも重要であることがわかっています。 ComK2 が形質転換遺伝子の制御に重要であるとはわかっていませんが、そのレギュロンは SigH および ComK1 のレギュロンと重要な重複を示しています。 最後に、SrrAB 2 成分系によって感知される微好気性条件が、黄色ブドウ球菌の能力を活性化する鍵であると提案します。

黄色ブドウ球菌などの適応性の高い共生生物は、細菌がさまざまな生態学的ニッチで増殖、感染、生存できるようにする一連の遺伝子を持っています。 一般に前鼻孔は黄色ブドウ球菌の本来の生態的ニッチであると考えられていますが、この細菌は皮膚、腋窩、鼠径部、消化管など人体の他の領域からも分離される可能性があります1。 通常、定着は有害ではありませんが、黄色ブドウ球菌は宿主の生来の防御を破って深部組織に侵入し、さまざまな表在性および浸潤性の感染を引き起こす可能性があります2。 さらに、黄色ブドウ球菌は通性嫌気性菌として、酸素の有無にかかわらず増殖して宿主の免疫系を妨害する能力を持っています。 黄色ブドウ球菌の環境は、感染の過程で嫌気性であるか嫌気性になることが知られているため、この能力は黄色ブドウ球菌にとって特に重要です3,4。

これらの顕著な適応力に加えて、黄色ブドウ球菌は、抗生物質の多剤耐性株の広範囲にわたる出現により、病院で最も恐れられる病原体の 1 つとなりました 5,6。 他の黄色ブドウ球菌株または他の属からの抗生物質耐性遺伝子の水平遺伝子伝達 (HGT) は、長年にわたり、もっぱら接合と形質導入によって媒介されると考えられていました 7。 しかし、数年前、黄色ブドウ球菌が遺伝子形質転換を自然に行う能力を持つことができるという実証により、この重要なヒト病原体における HGT を理解する方法が変わりました。

能力は、一部の細菌種がさまざまな環境信号に応答して発達する生理学的適応です9。 これらの刺激に応答して、細菌細胞はシグナル伝達経路をトリガーし、最終的に中枢能力調節因子を活性化します。 これらすべてのステップは、いわゆる初期コンピテンス遺伝子によって制御されます。 興味深いことに、中枢能力調節因子は、いくつかのモデル生物において転写活性化因子 10、11 または代替シグマ因子 12 として同定されています。 活性化されると、後期コンピテンス遺伝子の発現が開始され、その中には遺伝的形質転換に必須の遺伝子がすべて含まれています。

重要なことに、黄色ブドウ球菌では、代替シグマ因子である SigH13 と 2 つの転写制御因子である ComK1 および ComK214 という 3 つの潜在的な中枢能力制御因子が同定されています。 さらに、黄色ブドウ球菌は、CS28 と呼ばれる化学的に定義された培地中で自然に能力を誘導できることが示されています。 著者らは、CS2培地で8時間増殖させた後、最大1.6%のコンピテンス誘導細胞を検出し、形質転換効率は野生型株の検出限界（約10-10）にかろうじて達した8）。

この研究では、我々の主な目的は、ヒトの病原体である黄色ブドウ球菌の能力の発達を特徴付けることでした。 私たちの目標は、細胞によって感知される環境刺激やシグナル伝達経路から中枢能力調節因子とそのレギュロンに至るまで、関係するすべての段階を調査することでした。 このような目標を達成するために、我々はまず、黄色ブドウ球菌のプランクトン培養における能力の発達と遺伝子形質転換を最適化するプロトコルを開発しました。 次に、さまざまなレポーター株と包括的なトランスクリプトーム解析を使用して、黄色ブドウ球菌の能力発達における 3 つの中心的調節因子の役割を分析しました。 我々は特に、SigHとComK1はどちらも遺伝子形質転換に関与する遺伝子の発現に必須である一方、3つの調節因子（SigH、ComK1、ComK2）はすべてコンピテンス転写プログラムの完全な発達に必要であることを示した。 最後に、SrrAB 2 成分系 (TCS) によって感知され、おそらく SigH を活性化する酸素制限が、ヒトの病原体である黄色ブドウ球菌の能力の発達を制御していると我々は提案します。

私たちは、2012 年に森川氏と彼の同僚によって公開されたプロトコルを最適化することを初めて決定しました (詳細については、「材料と方法」を参照)。 結果を比較するために、comG 後期コンピテンス オペロンのプロモーター (PcomG-gfp)8 の制御下で gfp 遺伝子を発現する同じレポーター株を使用しました。 簡単に説明すると、まずレポーター株を BHI アガロース プレート上に画線培養しました。 次に、単離されたコロニーを使用して、BHI 培地での前培養物に接種します。 次いで、この前培養物を指数関数的増殖で迅速に停止し、遠心分離し、洗浄し、CS2培地中の新鮮な培養物を接種するために使用した。 新鮮なCS2でのこの初期培養物から、密閉ファルコンチューブで10倍段階希釈を行った。 最後に、細胞密度 (OD600 nm) とコンピテント GFP 発現細胞のパーセンテージを、各希釈培養物におけるフローサイトメトリーによって 30 分ごとに測定しました。 興味深いことに、図 1a、b は、私たちの最適化されたプロトコルが、特定の実験において集団の最大 70% の能力開発をどのように誘導できたかを示しています (実際、統計分析では、この割合は集団の 52 ± 15% と評価されました。 n = 12)。 このパーセンテージは文献よりも 10 倍以上高く、顕微鏡による GFP 発現細胞の検出を通じて以前に計算されました 8。 したがって、フローサイトメトリーによって実行された測定ではバイアスが導入されず、顕微鏡検査と同様の結果が得られることを確認しました（補足図1）。

a CS2培地中でのcomGプロモーター(St29)の制御下でgfpを発現する野生型株の16〜21.5時間の増殖。 10-2 から 10-5 までの希釈が示されています。 10-2 希釈はすでに定常期に入っていましたが、10-3 希釈は 16 時間の増殖後に定常期に入りました。 10-4 および 10-5 希釈は、実験の開始時にそれぞれ、後期および初期の指数関数的段階にありました。 すべての希釈は、2.4 ～ 2.6 の同様の最終 OD に達しました。 b フローサイトメトリーを使用して、comG プロモーター (PcomG) の制御下で GFP を発現する細胞の割合を分析することにより、コンピテント細胞の割合を測定しました。 パネル a) に示す各希釈培養物において、コンピテント GFP 発現細胞のパーセンテージは指数関数期後期に増加し、定常期の開始時に最大に達しました。 このグラフは、3 回繰り返された代表的な実験を示しています (生物学的複製、補足図 2a を参照)。 c プラスミド（pCN34、KanR、白いバー）を使用した野生型（N315ex w / o Phi）、comGA（St137）、sigH（St45）、comK1（St37）、comK2（St38）、およびsrrA（St117）変異株の形質転換効率) または染色体 DNA (灰色のバー) (詳細については、材料と方法を参照)。 結果は平均値 ± SD として表示されます。 各株について、実験は少なくとも 5 回繰り返されました (生物学的反復)。 個々の実験は青い円で示されています。 d 染色体DNAを使用した実験室株（N315、RN4220、およびUSA300）およびMRSA（NL10、NL27）またはMSSA（NL36）臨床分離株の形質転換効率（灰色のバー）（詳細は材料および方法を参照）。 結果は平均値 ± SD として表示されます。 各株について、実験は少なくとも 5 回繰り返されました (生物学的反復)。 個々の実験は青い円で示されています。

次に、能力開発の向上に関連する最適化されたプロトコルが形質転換効率の向上にもつながることを確認しました。 興味深いことに、実験室条件下では、N315野生型株はドナーDNAとして複製プラスミドを使用した場合、約1.5×10−7（±0.6×10−8）の形質転換効率に達しました（図1c）。 このような結果は、これまでに発表された結果の 1000 倍です8。 重要なことに、外因性DNAとして黄色ブドウ球菌株の染色体（抗生物質マーカーを保有、材料と方法を参照）を使用した場合、形質転換効率は4.2×10−6（±4.1×10−6）にも達しました（図1c）。 私たちのアッセイで成長しているコロニーが本物の形質転換体であることを確実に確認するために、遺伝的形質転換に必須の遺伝子であるcomGA 15 が欠失している株を使用して形質転換イベントが検出できないことも示しました（図1c）。

重要なのは、ここで説明し、N315 株用に最適化されたプロトコルは、他の実験室株 (RN4220 および USA300) および臨床分離株 (NL10、NL27、および NL36) も遺伝子形質転換に導くことです (図 1d)。 興味深いことに、RN4220 は非常に高い形質転換効率 (9.7 × 10−5 ±5.9 × 10−5 に達する) を示しましたが、USA300 (7 × 10−8 ±6.9 × 10−8) および臨床分離株 (NL10、1.2 × 10−7 ± 3.79 × 10−7; NL27、1.6 × 10−7 ±4.8 × 10−7 および NL36、1.2 × 10−7 ±7.9 × 10−7）は、N315 よりも低い数値を示しました。 これらの結果は、私たちのプロトコールの堅牢性を明らかに示していますが、新しい菌株にはさらなる最適化が必要な可能性があることも示しています。

図 1 は、最適化されたプロトコルを使用して各希釈培養物でコンピテンスがどのように誘導されたかを明確に示しています。 追加の希釈ごとに、増殖が 2 時間遅れることが特徴でした (図 1a)。 実際、10-5 希釈は、10-4 希釈よりも固定相に到達するまでにより多くの時間を必要とし、10-4 希釈は 10-3 希釈よりも多くの時間を必要とします。 したがって、能力の発達も、連続した希釈培養ごとに遅れました（図1b）。 ただし、GFP発現コンピテント細胞は、培養物がOD = 2に近づくと常に出現し、各培養物が定常期に入ると最大に達しました（図1a、b）。

能力の発達と細胞密度の間の相関関係の存在をさらに検証するために、この実験を3回繰り返しました（補足図2a）。 この相関関係は、CS2で増殖させた黄色ブドウ球菌の能力発達が、培養物が定常期に入り、OD600nmが約2.4（実際には2.2と2.6の間）で最大に達したことを明らかに示しました（補足図2a）。 クオラムセンシング（QS）を通じて細菌細胞によって感知される高い細胞密度は、能力を誘導する重要なストレスとして提案され、いくつかのモデル生物で検証されています16、17、18。 したがって、我々は、QS システムが黄色ブドウ球菌の能力の発達に関与している可能性があるという仮説を立てました。 興味深いことに、黄色ブドウ球菌では 2 つの QS システムが同定されています (Agr および Lux19)。 そこで、我々は最終的に、agrA (Agr システム転写調節因子をコードする 19) および luxS (Lux システム調節因子をコードする 19) 遺伝子の欠失が能力の発達に及ぼす影響を調査した。 驚くべきことに、これらの遺伝子はいずれもcomGオペロンの発現の誘導に関与していないことがわかりました（補足図2b）。 この結果は、特に agrAC の欠失により能力が 3 倍低下した最近のデータと比較した場合、驚くべきものに見えました 20。 この研究で使用されたプロトコルは私たちのものとは異なりますが、QS がすべての条件に関与しているとは限らない理由を理解するには、さらなる調査が必要です。

冒頭で述べたように、3 つの潜在的な能力調節因子が文献で特定されています。 SigH は PcomG8 からの発現を活性化するのに重要であることが示されていますが、ComK1 と ComK2 には明確な役割は割り当てられていません。 ここでは、最適化されたプロトコールを使用して、4 つのプロモーターからの発現に対する sigH、comK1、および comK2 の欠失の影響をテストすることにしました: PcomG (SigH の過剰発現によってのみ活性化されるプロモーター、8,14)、Pssb (SigH の過剰発現によってのみ活性化されるプロモーター) ComK1 の過剰発現 14)、PcomC および PcomF (どの調節因子によっても活性化されなかった 2 つのプロモーター 14) によって活性化されます。

予想どおり、野生型バックグラウンドでは、4 つのプロモーターが活性化されており、GFP 発現細胞の平均割合は PcomG で 51.87%、Pssb で 77.26%、PcomC で 38.32%、PcomF で 38.56% でした (図 2 および補足図3)。 sigH を削除すると、PcomG からの発現のみが失われました (図 2a)。 この結果は、SigH がすべての遺伝子形質転換遺伝子の発現を制御しているわけではなく、少なくとも 1 つの追加の制御因子が関与している必要があることを裏付けています。 興味深いことに、comK1が不活化されると、すべてのプロモーターからの発現が消失しました（図2a〜d）。 したがって、ComK1 は SigH と並んで comG オペロンの発現に必須ですが、単独でも ssb および comC の発現に絶対に必要です。 興味深いことに、comK1の欠失によりcomF発現が消失する一方、sigHの欠如によりcomF発現がほぼ2倍減少するため、comF制御は中間であるように見えました（図2d）。 最後に、comk2 変異体では、すべてのプロモーターに対して効果が検出されませんでした。

PcomG (St29、St51、St40、および St 41) (a)、Pssb (St50、St61、St64、および St67) (b)、PcomC (St48、St60、St63、および St66) の制御下で GFP を発現する集団の割合）（ｃ）、および野生型バックグラウンドまたはｓｉｇＨ、ｃｏｍＫ１、またはｃｏｍＫ２の非存在下におけるＰｃｏｍＦ（Ｓｔ２３３、Ｓｔ２３５、Ｓｔ２３４、およびＳｔ２３６）（ｄ）を、ＣＳ２培地で２１時間増殖させた後に決定した。 結果は平均値 ± SD として表示されます。 各実験は少なくとも 5 回繰り返されました (生物学的反復)。 個々の実験は青い円で示されています。

私たちの結果（図2）を完成させ、SigH、ComK1、およびComK2レギュロンを徹底的に特徴付けるために、次に、これら3つの個別のレギュロンをコードする遺伝子の欠失がコンピテンスに及ぼす影響を比較することにより、RNAシークエンシングによる全体的な転写解析を実行しました。転写プログラム。

まず、自然の遺伝子形質転換に関与する遺伝子に焦点を当てました（図3および補足表1）。 いくつかの小さな違いがあるにもかかわらず、以前に得られた結果が確認されました (補足ノート 1 で説明)。 全体として、SigH と ComK1 はどちらも、ComK1 によってのみ制御される ssb を除いて、ほとんどの遺伝子形質転換遺伝子の発現に必須であることがわかりました。 繰り返しになりますが、ComK2 に起因する役割はありませんでした。 最後に、中枢能力調節因子をコードする遺伝子が個別に削除された株の形質転換効率を検証しました（図1c）。 予想通り、sigHまたはcomK1が存在しない場合のみ遺伝的形質転換が無効となり、一方、comK2変異体は野生型株に匹敵する形質転換効率を示しました（図1c）。

発現が誘導される (>2 倍、a) または抑制される (>2 倍、b) 後期コンピテンス遺伝子。 各色付きの円は、SigH (青色)、ComK1 (黄色)、ComK2 (緑色)、または 3 つ (黒色の円の外側) によって発現が活性化または阻害されるレギュロンを表します。 各カテゴリーの遺伝子の数は、同じ遺伝子が複数の制御因子によって制御されている場合には、円の内側または円の交点に表示されます。 以下の表は、発現が 2 倍、3 倍、または 5 倍の因子によって誘導または抑制される遺伝子の総数を示しています。 活性化された (c) および抑制された (d) 後期コンピテンス遺伝子 (>2 倍) も機能ごとに表示されます。 各中枢能力制御因子 (SigH は青色、ComK1 は黄色、ComK2 は緑色) によって制御される遺伝子の数は、同じ遺伝子が複数の制御因子によって制御されている場合は円の内側または円の交点に示されます。

他のモデル生物では、コンピテンス転写プログラムには常に、遺伝子形質転換に関与する遺伝子だけでなく、より多くの遺伝子が含まれています 21、22、23、24。 黄色ブドウ球菌にも明らかに当てはまります。 実際、sigH、comK1、comK2変異株と比較して、野生型株では213/73/95遺伝子が少なくとも2倍過剰発現していることがそれぞれ見出された（図3a）。 さらに、より高い過剰発現カットオフを考慮した場合、過剰発現が見つかった遺伝子の数は依然として重要であり、84/38/53 個の遺伝子が 3 倍の因子で過剰発現され、さらに 35/23/31 個の遺伝子が 5 倍の因子で過剰発現されました。 。 ここで見つかった数値、特に 3 倍の発現因子の数値は、別のモデル生物で記載されている数値と非常に似ており 21、22、23、24 、黄色ブドウ球菌における約 100 個の後期コンピテンシー遺伝子の真のコアセットを明らかにしています。

次に、黄色ブドウ球菌のコンピテンス転写プログラム中に誘導される遺伝子に関連する機能を分析しました（図3c、補足表2〜4）。 天然の遺伝子形質転換遺伝子に加えて、我々は、(i) ストレス応答の調節に関与する遺伝子 (主に、ただし排他的にではなく ComK2 によって制御される)、(ii) 複数の推定上の毒素/抗毒素システムをコードする遺伝子 (3 つの制御因子によって制御される) を発見しました。 ）、（iii）アミノ酸および核酸の代謝に関与する遺伝子（SigHおよびComK2によって制御される）、および（iv）鉄輸送に関与する遺伝子（主に、ただし独占的に制御されるわけではない）。 重要なことに、我々の結果は、たとえSigHとComK1だけが遺伝子形質転換遺伝子の発現に必須であるとしても、中心的コンピテンス調節因子（すなわち、SigH、ComK1、およびComK2）はすべてコンピテンス転写遺伝子の完全な発達には絶対に必要であることを明確に証明した。黄色ブドウ球菌におけるプログラム。

我々の全体的な転写解析により、黄色ブドウ球菌の能力の発達中に多数の遺伝子の発現が阻害されていることも明らかになった。 実際、sigH、comK1、またはcomK2の個々の変異株と比較して、野生型株では合計399個の遺伝子が阻害されている（>2倍）ことがわかりました（図3b）。 これは、N315 黄色ブドウ球菌のゲノムに存在する全遺伝子の 15% 以上に相当します。

興味深いことに、抑制された遺伝子の 10% 以上 (正確には 37) が病原性または病原性制御に直接関与しています (図 3d、補足表 5)。 これらの遺伝子の中には、莢膜 (CapA-O)、セリンプロテアーゼ (SplA-F、SspA-C)、細胞間付着因子 (IcaAB)、細胞外タンパク質 (Hlg、Coa)、表面をコードする遺伝子など、よく特徴付けられた多くの病原性因子が見つかりました。タンパク質（ClfAB、fnb、FnbB、geh、sdrCD、Spa）およびリパーゼ（Geh）。 さらに、in vivo で 20 を超える病原性因子の発現を促進することが知られている重要な TCS、saeRS26 の発現が、コンピテンス中に抑制されることが判明しました。 すべての中枢能力調節因子が病原性抑制に関与していることが判明したにもかかわらず、SigH と ComK2 は、それぞれが抑制する遺伝子間の重要な重複により主要な役割を果たしました（図 3d、補足表 5）。 残念ながら、野生型と sigH または comK2 変異体エキソプロテオームの比較では、病原性因子の数に有意な差は示されませんでした（補足図 4）。 重要なのは、私たちの培養では、コンピテント細胞と非コンピテント細胞の 2 つの集団が共存しており、それぞれが総集団の 50% に相当します。 したがって、非コンピテント細胞は依然として病原性因子を産生するため、培養物中で産生される病原性因子の総量に対するコンピテント細胞に関連する阻害の効果は過小評価されるであろう。 あるいは、細胞は、エキソプロテオームへの影響を観察するのに適切ではない時点で収集された可能性があります。

最後に、黄色ブドウ球菌における能力の発達は、酸素利用可能性の違いに関連するさまざまな条件下で実証されています8。 したがって、我々は、黄色ブドウ球菌に存在する酸素感知性TCS（すなわち、SrrAB27、NreBC28、およびAirRS29）が、CS2培地における浮遊増殖の過程における初期の能力調節段階に関与しているのではないかと考えた。 このような仮説を検証するために、野生型株と srrA、nreC、airR 変異株の comG プロモーターからの発現を比較しました。 この実験では、nreCおよびairRの欠失はcomGプロモーターからの発現に影響を与えませんでした（図4a）。 しかし、srrAが存在しない場合、comG発現は7倍減少しました(図4a)。 SigHとComK1の両方がcomGオペロンの発現に関与しているため（図2a）、次にどの中枢能力制御因子がSrrABの制御下にあるかを決定することにしました。 ssb 発現は ComK1 によってのみ制御されていることが判明したため (図 2b)、最終的に srrA 欠失がその発現に及ぼす影響をテストしました。 srrAが存在しない場合、ssbの発現は影響を受けませんでした（図4b）。 さらに、sigHとsrrAの両方の欠失は、sigHとsrrAの個々の変異株と同じ影響をssb発現に及ぼしました（図4b）。 まとめると、これらの結果は、SrrAB が SigH を活性化して comG プロモーターからの発現を制御する可能性があることを示唆しました。 さらに、能力開発および遺伝子形質転換につながる調節経路における SrrAB の関与は、srrA の欠如が黄色ブドウ球菌の遺伝子形質転換効率に影響を与えるに違いないことを意味します。 実際、srrA遺伝子を欠失させると、黄色ブドウ球菌の遺伝子形質転換効率の15倍および19倍の減少（それぞれプラスミドまたは染色体DNAを使用して得られる）が観察されました（図1c）。

a 野生型 (St29)、ssrA (St145)、nreC (St158)、および airR (St177) 変異株における PcomG から GFP を発現する細胞の割合。 結果は平均値 ± SD として表示されます。 各実験は少なくとも 5 回繰り返されました (生物学的反復)。 個々の実験は青い円で示されています。 b 野生型 (St50)、srrA (St147)、sigH (St61)、および srrA/sigH 二重変異体 (St252) 株における Pssb から GFP を発現する細胞の割合。 結果は平均値 ± SD として表示されます。 各実験は少なくとも 5 回繰り返されました (生物学的反復)。 個々の実験は青い円で示されています。

酸素感知 TCS により、黄色ブドウ球菌は微好気性または嫌気性条件を調査し、反応することができます。 特に、SrrAB は、低酸素条件下で病原性因子の全体的な調節因子であることが示されています 27。 したがって、CS2 培地での黄色ブドウ球菌の増殖中に、培養中の酸素濃度が低下したと推測したくなります。 この仮説を検証するために、最終的に CS2 での成長中の溶存酸素濃度を測定しました (図 5 および補足図 5)。 興味深いことに、OD が増加し始めると、酸素濃度は急速に低下しました。 実際、酸素濃度は最初の 8 時間は 21% で一定でしたが、次の 6 時間で 0.27% まで減少しましたが、培養物の OD は 0.5 にしか達しませんでした。 酸素濃度が最低点に達した数分後、これらの新たな低酸素条件に適応するために、培養は再現性よく約 1 時間停止しました (図 5)。 最後に、酸素濃度の低下と増殖の停止に続いて、GFP を発現するコンピテントセルが出現し始めました (図 5)。 したがって、最適化されたプロトコールを使用すると、CS2 培地での増殖は酸素利用可能性の急速な制限に関連し、SrrAB によって感知される微好気性条件をもたらし、それが次に黄色ブドウ球菌の能力を誘導するために SigH を活性化することを自信を持って提案できます。

PcomGの制御下でGFPを発現する野生型株(St29)をCS2培地で24時間増殖させた。 増殖が検出可能になったとき、酸素濃度、GFP 発現細胞の割合、および OD600 nm を 30 分ごとに測定しました。 OD が増加するにつれて、酸素濃度は 21% から 0.27% に急速に低下しましたが、OD は 0.5 にしか達しませんでした。 重要なのは、当社のセンサーは 10 分の 1 低い酸素濃度を自信を持って測定できるため、当社のアッセイにより、完全な嫌気性条件に達していないことを確認できます。 数分後、増殖は再現性よく一時停止を示しました。これはおそらく細胞が低酸素条件に適応するために必要であり、その結果、コンピテント GFP 発現細胞の割合の増加が誘導されました。 この図は、5 回再現された代表的な実験を示しています (反復については補足図 5 を参照)。

これまでの Fagerlund らの研究 14 では、中枢能力制御因子の個別または複合的な過剰発現では黄色ブドウ球菌の能力の完全な発達を誘導するのに十分ではないことが明確に証明されていた。 この研究では、黄色ブドウ球菌における遺伝的能力の最適な誘導を可能にする最適化されたプロトコルを紹介します。 このようなプロトコルは、ここで提案されている遺伝子研究を導くために不可欠でした。 重要なことに、いくつかの実験室株および臨床分離株で検出された形質転換効率は、最終的に、この HGT 機構が in vivo で黄色ブドウ球菌の遺伝的可塑性および抗生物質耐性遺伝子の獲得を調節する真の可能性を実証していることです。

さらに、黄色ブドウ球菌におけるコンピテンス転写プログラムの完全な発達には、3 つの中枢コンピテンス制御因子が不可欠であることも確立しました。 SigH の重要性はすでに知られていましたが、我々は遺伝子形質転換に関与する遺伝子の発現に ComK1 が不可欠であることを初めて実証しました。 重要なことは、ComK2 が SigH や ComK1 と並んで、コンピテンス転写プログラムの完全な開発にどのように関与しているかも明らかにすることです (図 6)。 実際、私たちの世界的なトランスクリプトーム研究は、遺伝的形質転換に加えて、他の多くの機能も有能期間中に誘導されることを明らかに示しており、これは他のモデル生物と共有される特徴です。 将来的には、これらの他の生物学的プロセス（すなわち、ストレス応答 30、アミノ 31 および核酸 32 の酸代謝、または毒素/抗毒素システム 33,34）が環境適応能力の確立にどのように関与しているかを調査することが重要である。

3 つの中心的能力制御因子、すなわち SigH、ComK1、および ComK28、14 が特定されています。 3 つの調節因子はすべて、コンピテンス転写プログラムの完全な開発に不可欠です。 SigH および ComK1 は遺伝子形質転換遺伝子の発現に絶対に必要ですが、ComK2 (SigH および ComK1 と並んで) は追加の細胞機能 (すなわち、ストレス応答、毒素/抗毒素システム、アミノおよび核酸の代謝、鉄など) の誘導にも不可欠です。輸送…）。 さらに、能力の発達は、主に SigH と ComK2 によって制御される毒性の抑制によって特徴付けられます。 最後に、培養中の酸素濃度が大幅に減少すると、能力の自然な発達が誘導されることを示しました。 この酸素希薄化はおそらく SrrAB の 2 成分系によって感知され、次に中枢能力調節器 SigH を活性化します。

黄色ブドウ球菌における 3 つの中枢能力調節因子の存在と関与は、それぞれがおそらく異なるシグナル伝達経路によって誘導されるものであり、顕著な特徴である。 SigH、ComK1、および ComK2 レギュロンの重複は、そのような重複がすでにコレラ菌で記載されており、2 つの中心的能力制御因子が同定されているにもかかわらず、別の 1 つです 35。 1つの仮説は、黄色ブドウ球菌が遺伝子形質転換に適格になるかどうかを決定するためのより広範囲の合図を統合するために、複数の制御経路を必要とするということである可能性がある。 この仮説によれば、黄色ブドウ球菌の遺伝的能力の最適な発達を可能にするためには、いくつかの環境シグナルが同時に存在するはずである。 一方で、このような複雑な世界的規制は、黄色ブドウ球菌が最適な条件にない場合に、能力開発を調節するための複数の標的を提供します。 興味深いことに、微好気環境では遺伝子形質転換遺伝子の発現を制御しない ComK2 が、さまざまな特定の環境シグナルに応答して関与し、黄色ブドウ球菌の能力発達の制御を複雑にする可能性がある。

さらに、黄色ブドウ球菌における能力発達の制御が、いくつかの重要な歴史的モデル生物、すなわち系統発生的にSigH13に近い肺炎球菌とその代替シグマ因子（ComX）、枯草菌とその中心的能力と特徴を共有していることに言及するのは興味深い。いくつかの中心的能力調節因子の存在を通じて、ComK1 および ComK214 およびコレラ菌と相同な調節因子 ComK 18。 したがって、これらの歴史的モデル生物に存在する他の調節特徴も黄色ブドウ球菌によって能力の発達を制御または調節するために使用できるかどうかを将来テストすることは興味深く、おそらく重要である。

最後に、SrrAB TCS によって感知される微好気性条件につながる酸素制限が、黄色ブドウ球菌の能力の発達をどのように制御するかを実証します。 私たちの培養は、以前に発表されたものと同様に密閉管内で行われるため 36、CS2 での黄色ブドウ球菌の増殖により、大気中の酸素では置き換えられない溶存酸素が急速に消費されると考えられます。 文献からの結果は、黄色ブドウ球菌が異なる酸素濃度下で能力を誘導する能力を持っていることをすでに示している8,20。 嫌気的条件下 8、バイオフィルム形成中 20、または ROS 37 に応答した能力の誘導は、この考えをさらに強化します。 我々はまた、SrrABが環境酸素濃度の変化に応答してSigHを(転写、翻訳、または安定性を通じて)活性化できる可能性があることを提案した。 酸素濃度の低下が SrrAB を介して SigH を直接的または間接的にどのように活性化するかを完全に理解するには、さらなる研究が必要となります。 興味深いことに、Cordero らの研究は、能力開発が炭素代謝の劇的な変化とどのように関連しているかを示しています 37。 したがって、酸素制限に応じた細胞生理機能の調節が、黄色ブドウ球菌の能力の発達に関与しているかどうかをテストすることが重要であろう。

重要なことに、黄色ブドウ球菌は生体内で微好気条件にしばしば遭遇する。 実際、感染症では、エネルギーを消費する活性化好中球が酸素欠乏を引き起こす一方、マクロファージ、樹状細胞、T細胞が炎症を誘発し、組織への血流が変化し、酸素レベルが劇的に低下します38。 さらに、バイオフィルム関連感染症 39 または膿瘍 40 の際には、酸素が制限された微小環境が形成されます。 したがって、感染の過程で、黄色ブドウ球菌はこの原稿に記載されている環境条件にさらされることが多く、遺伝子形質転換能力の発達につながり、生体内でのこの HGT モードの真の可能性が強化されます。 しかし、我々の包括的なトランスクリプトーム解析では、能力の自然な発達中に多数の病原性遺伝子の転写が抑制されていることも明らかになりました（図6）。 したがって、in vivo モデルとして、感染の過程で黄色ブドウ球菌細胞が病原性レギュロンの発現を誘導し、最終的には局所的な酸素欠乏を引き起こすと考えられます。 次に、人口の限られた割合がこの環境信号を感知し、それに応答して、人口の限られた部分に遺伝子形質転換の能力を誘導します。 最終的に、有能な黄色ブドウ球菌細胞は病原性を抑制し、HGT を促進しますが、残りの細胞は感染を促進し続けます。

N3158、RN422041、および USA30042 黄色ブドウ球菌株、およびこのプロジェクトで使用した臨床分離株 43 はすべて補足表 6 にリストされています。黄色ブドウ球菌株は、BHI 培地 (Becton、Dickinson、および Company) または完全合成培地で増殖しました。実験に応じて、CS28 と呼ばれる培地を使用します。 必要に応じて、特定の事象を選択するために抗生物質が使用されました (Kan、200 μg/mL、Cm、10 μg/mL)。

細胞は、BHI プレート上の -80 °C ストックから単離されました。 4つのクローンを10 mLのBHIに接種し、ODが2.5に達するまで180 rpmで振盪しながら37℃でインキュベートしました。 次に、この前培養物を遠心分離し、新鮮な CS2 培地で洗浄し、密閉した 50 mL Falcon チューブ内の 10 mL の新鮮な CS2 培地 (OD = 0.5) に接種するために使用しました。 この最初の CS2 培養物から、10 倍連続希釈を実行して、10-1、10-2、10-3、10-4、および 10-5 の培養物を生成し、50 mL ファルコン チューブを密閉し、必要に応じてそれ以上の培養物を生成しました。 増殖に合わせて個々のサンプルを採取するために、希釈ごとにいくつかのチューブを準備しました（つまり、各 Falcon チューブは 1 つのサンプルに対して 1 回だけ開けられました）。 最後に、希釈液を 120 rpm で振盪しながら 37 °C で一晩インキュベートしました。 細胞は、OD が 2 ～ 2.2 のとき (GFP レポーター株、図 2 および 3)、または増殖中 (GFP レポーター株、図 1、酸素測定、図 4) に収集されました。

ギブソンアセンブリ法を使用して、目的のプロモーターを pRIT-GFP プラスミド 44 に挿入しました。 プロモーターと pRIT-GFP プラスミドは、最初に専用のプライマーを使用して増幅されました。 この研究で使用したすべてのオリゴヌクレオチドを補足表 7 に示します。すべてのプライマーのテールで、各プロモーターの末端と pRIT-GFP 線状プラスミドの間に 25 ～ 50 bp の相同重複領域を設計しました。 プロモーターおよびpRIT-GFPプラスミドは、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientificから購入)を使用して増幅されました。 次に、すべての PCR フラグメントを標準的な市販のシリコン カラム (PCR クリーンアップ キット、Macherey-Nagen) を使用して精製し、ゲル電気泳動によって非特異的または微量の PCR フラグメントが存在しないことを確認しました。

ギブソンアセンブリマスターミックスは、320 μL の 5× ISO バッファー (25% w/v PEG-8000; 500 mM Tris-HCl、pH 7.5; 50 mM MgCl2; 50 mM DTT; 5 mM NAD; 1 mM 各 dNTP) を加えて調製しました。 ）、0.64μLの10U/μL T5エキソヌクレアーゼ、20μLの2U/μL Phusionポリメラーゼ、160μLの40U/μL Taq DNAリガーゼ、および699.36μLの水（すべての試薬はNew England Biolabsから購入した）。 100 ng の直鎖状 pRIT プラスミドと 3 倍過剰のインサートを含む 5 マイクロリットルの 2 つの DNA フラグメント混合物を、15 μL の Gibson アセンブリ マスター ミックスに添加しました。 次に、反応チューブを 50 °C で 1 時間インキュベートしました。 最後に、アセンブリ反応液 1 μL を IM08B エレクトロコンピテント大腸菌細胞に形質転換しました。 形質転換された大腸菌細胞を、100 μg/mL アンピシリンを含む LB 寒天上で 37 °C でインキュベートしました。

予想されるプラスミドを含む形質転換体を選択するために、コロニーPCRを実施した。 得られたプラスミドを陽性形質転換体（一晩培養）から抽出し、市販のキット（NucleoSpin Plasmid 抽出キット、Macherey-Nagen）を使用して精製しました。 全てのプラスミドはシークエンシング（GATC社）により検証された。 最後に、最終レポーター株を取得するために、黄色ブドウ球菌エレクトロコンピテント細胞を構築された各プラスミドで形質転換した。

表S1にリストされている、黄色ブドウ球菌の能力発達の調節に関与すると予測される主要な遺伝子の役割を調べるために、対立遺伝子置換構築物を温度感受性pIMAYプラスミド44にクローニングしました。 本研究でクローニングに使用したすべてのプライマーを補足表7に示します。削除する遺伝子の1 kbp隣接領域に対応するフラグメントを、マルチクローニングと互換性のある制限酵素部位に隣接するプライマーを使用して黄色ブドウ球菌N315ゲノムDNAから増幅しました。 pIMAY のサイト (MCS)。 上流または下流の領域を、選択した 2 つの制限酵素を使用して消化し、pIMAY にライゲーションし、同じ酵素で開環しました。 得られたプラスミドをIM08B大腸菌株に電気形質転換した。 次に、コロニー PCR を使用して、形質転換体に存在するプラスミドの構造を確認しました。 市販のキット（NucleoSpin Plasmid 抽出キット、Macherey-Nagen）を使用して、陽性コロニーからプラスミドを精製しました。 プラスミド (GATC 社) の配列を確認した後、黄色ブドウ球菌 N315ex woφ 株をエレクトロポレーションによって形質転換し、クロラムフェニコール (10 mg/mL) を補充した BHI 寒天培地上にプレーティングし、28 °C でインキュベートしました。

pIMAY を染色体に組み込むために、形質転換プレートからの単一コロニーを 200 μL の BHI に再懸濁しました。 懸濁液を 10 倍の 10-3 まで希釈し、各希釈液 100 μL をクロラムフェニコール (10 mg/mL) を補充した BHI 上に広げ、37 °C で一晩インキュベートしました。 翌日、引き続き同じ条件でコロニーを画線培養した。 一方、コロニー PCR 分析を実行して、染色体外 pIMAY が存在しないこと、およびプラスミドの組み込みが上流領域または下流領域で起こったかどうかを確認しました。

コロニー PCR の結果に基づいて、クロラムフェニコールを含まない 28 °C の BHI 中で一晩培養しました。 次いで、一晩培養物を10-7まで10倍に希釈した。 10-4 ～ 10-7 希釈液 100 マイクロリットルを、1 μg/mL アンヒドロテトラサイクリン (aTc) を含む BHI 上にプレーティングしました。 プレートを 28 °C で 2 ～ 3 日間インキュベートしました。 次いで、コロニーをBHI (抗生物質なし) およびクロラムフェニコール (10 mg/mL) を補充したBHI プレートにパッチし、37 °C で一晩増殖させました。 クロラムフェニコール感受性コロニーをコロニー PCR によってスクリーニングして、目的の変異を含むクローンを同定しました。 突然変異株は、PCR および DNA 配列決定によって最終的に検証されました。

CS2での増殖後、11,000gで1分間遠心分離して500μLの細胞を回収しました。 細胞を固定するために、ペレットを 500 μL の冷 70% エタノールに再懸濁し、氷上で 20 分間インキュベートしました。 次に、黄色ブドウ球菌細胞を、11,000gで1分間遠心分離した後、500μLのPBS(pH7.4)に再懸濁した。 最後に、GFPを発現する集団のパーセンテージをフローサイトメトリー(Cytoflexトップベンチサイトメーター、Beckman-Coulter)によって評価した。 個々の細胞を識別するための前方散乱検出および側方散乱検出に続いて、488 nm レーザーを使用して、GFP を発現しない株（St12）の自己蛍光と比較することにより、GFP 発現コンピテント細胞を区別しました（補足図 1a を参照） ）。

GFP は非常に安定したタンパク質であることに言及することが重要です。 したがって、コンピテントセルの最大パーセンテージに達すると、この数は数時間にわたって一定のままでした。 この機能は、コンピテンスが何時間も「開いた」ままであることを意味するのではなく、一度最大値に達すると、新しいコンピテントセルが出現しないことを意味します。

CS2での増殖後、細胞を回収し、上で説明したように処理しました(フローサイトメトリーを参照)。 細胞の蛍光画像は、共焦点レーザー走査型顕微鏡 (ImagerieGif プラットフォーム) を使用して撮影されました。 GFP は青色レーザーを使用して 488 nm で励起され、緑色チャネルを使用して蛍光画像が収集されました。 画像はImageJソフトウェアを使用して再構成されました。

野生型株 (St12) と comGA (St137)、comK1 (St37)、comK2 (St38)、および sigH (St45) 変異株を、当社の最適化された希釈プロトコルを使用して適格になるまで最初に増殖させました。 各菌株の -2 希釈培養を使用して形質転換実験を行うことを選択しました。 細胞は、いくつかの調整を加えて以前に公開されたプロトコールに従って自然に形質転換されました8。 簡単に説明すると、各時点 (30 分ごと) で、4 °C、10,000 g で 1 分間の遠心分離によって 2 mL の細胞を回収し、2 mL の新鮮な CS2 に再懸濁し、2 本のチューブに均等に分割しました。 1 または 5 μg のドナー DNA (プラスミドまたは染色体) をチューブの 1 つに加え (2 番目のチューブは「DNA なし」コントロールとして使用)、180 rpm で撹拌しながら 37 °C で 2.5 時間インキュベートしました。 各チューブからの 10 μL または 100 μL (DNA 入りチューブ) または 1 mL (「DNA コントロールなし」) を、抗生物質とともに 55 °C に予冷した溶解 BHI 寒天 25 mL と最終的に混合し、混合物をペトリ皿。 固化後、プレートを 37 °C で 48 時間インキュベートしました。 各時点で、BHI 寒天プレートでの段階希釈によって生存率も評価しました。 形質転換効率は、最終的に、1 mL の培養物中で検出された形質転換体の数を同じ体積内の細胞の総数で割ることによって計算されました。 図1cに示されている数値は、各実験中の増殖に沿って検出された最高の形質転換効率の平均を表しています。 強い統計的関連性を得るために、実験は各菌株に対して少なくとも 5 回繰り返されました。

プラスミド。 pCN34 プラスミド (Kan45) は、遺伝子形質転換実験の一部で使用されました (図 1c)。 pCN34はSt197株から精製した。 簡単に言うと、50 mLの培養物を遠心分離によって回収し、プラスミド精製キット(Macherey-Nagen)を使用してプラスミドを精製した。

染色体 DNA。 St294株を使用してドナー染色体DNAを提供した（図1c、d）。 St294 では、pIMAY-INT14 プラスミド (Cm) が染色体の INT 染色体部位 14 に挿入されました。 プラスミドの挿入は PCR によって確認されましたが、複製するプラスミドは検出できませんでした。 簡単に説明すると、100 mL の培養物を遠心分離し、500 μL のプロテイナーゼ K (10 mg/mL)、2 mL の溶解液を補充した 5 mL の TEG (トリス 5 mM、pH8、EDTA、10 mM、グルコース、1%) に再懸濁しました。緩衝液（ＮａＯＨ、０．２Ｎ；ＳＤＳ、１％）および２０ｇのガラスビーズ（Ｓｔｒａｔｅｃｈ、＃１１０７９－１０５、直径０．５ｍｍ）。 次いで、各サイクル間に氷中で１分間のボルテックスを５サイクル（各１分間）使用して細胞を破壊した。 細胞溶解を終了するには、3 mL の溶解バッファーを室温で 5 分間加え、6 mL の NaAc (3 M、pH 4.8) で中和しました。 最後に、上清に存在する染色体 DNA を、-20 °C で 2 時間インキュベートした後、96% エタノール (上清 500 μL に対して EtOH 1 ml) を使用して沈殿させました。 遠心分離後、300μLの冷70%エタノールを使用して染色体DNAを洗浄した。 沈殿した染色体 DNA を最終的に 300 μL の Tris 5 mM、pH8 に再懸濁しました。

サンプリングと分離。 黄色ブドウ球菌の培養物を、OD600 が 2 に達するまで 37 °C、180 rpm の CS2 培地で増殖させました。細胞の代謝/転写を抑制し、RNA を安定化するために、4 °C、10,000 g で 1 分間遠心分離して細胞を回収し、ペレットは、-80 °C で保管する前に液体窒素中で直ちに凍結させました。 4 つの株のそれぞれについて 3 つの独立した生物学的複製を収集しました (野生型、St29; ΔcomK1、St40; ΔcomK2、St41; ΔsigH、St61)。 RNAの抽出のために、Lysing Matrix BおよびFastPrep装置(両方ともMP Biomedicals)を使用して細胞を溶解し、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用してRNAを単離した。 RNAをTURBO DNase (Ambion)で処理し、RNeasy Mini Kit (Qiagen)のRNA Cleanupプロトコルを使用して精製し、-80℃で保存しました。 RNA の完全性は、Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies) を使用して最終的に分析されました。

rRNA の枯渇、ライブラリーの構築および配列決定。 RiboZero rRNA 除去キット (Epicenter) を使用した 23 S、16 S、および 5 S rRNA の除去 (2 回)、サイズ範囲 100 ～ 500 bp のフラグメントを生成する鎖特異的ライブラリーの構築、12 のインデックス付きライブラリーのプール、シーケンス75 nt ペアエンド プロトコルを備えた Illumina HiSeq2000 機器の 1 つのフローセル レーンで、インデックス付きリードの 12 サンプルの逆多重化は、米国統合生物学研究所の「次世代シーケンシング (NGS) コア施設」によって実行されました。セル (I2BC、Gif sur Yvette、フランス)。

差次的発現のマッピングと分析を読み取ります。 注釈付きのすべての特徴の差次的発現は、R 統計プログラミング環境を使用して評価されました。 野生型株サンプル (St29、n = 3) と、sigH、comK1、または comK2 が存在しない 9 つのサンプルのそれぞれ (各 n = 3) の間で差次的発現を測定しました。 発現差解析の結果を補足表 2 ～ 5 に示します。 偽発見率 (FDR) で補正した P 値が 0.01 未満で、差次的発現の比が 2、3、または 5 を超える遺伝子は、有意に差次的に発現しているとみなされ、表示されます。

データへのアクセシビリティ。 RNA-seq データのセット全体は GEO 申請 GSE224932 に基づいて編集され、アクセス可能です。

エキソタンパク質の単離。 黄色ブドウ球菌培養物（野生型、Ｓｔ１２；ΔｓｉｇＨ、Ｓｔ４５およびΔｃｏｍＫ２、Ｓｔ３８）を、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中の１０ｍＬのＣＳ２中で１９．５時間増殖させた。 培養上清を 6000 rpm で 10 分間 (4 °C) 遠心分離して細菌を除去し、続いて 0.22 μm フィルターで濾過して細胞破片を除去しました。 培養上清中のタンパク質を 20% (v/v) トリクロロ酢酸 (TCA) 中で 4 °C で一晩沈殿させました。 沈殿したタンパク質を13000 rpmで45分間(4℃)遠心分離することにより沈降させ、ペレットを96%エタノールで洗浄した。 最後に、タンパク質ペレットを 13,000 rpm で 30 分間 (4 °C) 遠心分離し、残ったエタノールを除去し、ペレットを風乾させました。

細胞外タンパク質のプロファイリング。 沈殿した外来タンパク質を18μlの1×PBSに再懸濁し、室温で30分間インキュベートした。 20μlの2×Tris-Glycine SDS Novex緩衝液(ThermoFisher)および1M DTTを添加した後、サンプルを95℃で10分間インキュベートした。 外来タンパク質は最終的に 4 ～ 12% トリスグリシンゲル (Invitrogen) で分離され、クーマシー染色を使用して視覚化されました。

エキソタンパク質サンプルの調製と LC-MS 分析。 サンプル全体を含むバンドを切断し、還元とアルキル化を含む標準条件を使用してゲル内トリプシン消化を行いました。 トリプシン生成ペプチドは、timsTOF Pro 質量分析計 (Bruker) に接続された nanoElute 液体クロマトグラフィー システム (Bruker) を使用した nanoLC-MSMS によって分析されました。 ペプチドを Aurora 分析カラム (ION OPTIK、25 cm × 75 m、C18、1.6 m) にロードし、溶媒 B の 0 ～ 35% の勾配で 100 分間分離しました。 溶媒 A は水中の 0.1% ギ酸および 2% アセトニトリルであり、溶媒 B は 0.1% ギ酸を含むアセトニトリルでした。 MS および MS/MS スペクトルは、移動度スキャン範囲 0.6 ～ 1.4 V s/cm2 で m/z 100 ～ 1700 まで記録されました。 MS/MS スペクトルは、PASEF (Parallel Accumulation Serial Fragmentation) イオン移動度ベースの取得モードで、PASEF MS/MS スキャンの数を 10 に設定して取得しました。

データ分析。 MS および MSMS の生データは、データ分析ソフトウェア (Bruker) で処理され、mgf ファイルに変換されました。 タンパク質の同定は、黄色ブドウ球菌データベースに対して MASCOT 検索エンジン (Matrix Science、ロンドン、英国) を使用して実行されました。 データベース検索は、2 つの切断ミスの可能性があるトリプシン切断特異性を使用して実行されました。 システインのカルバミドメチル化を固定修飾として設定し、メチオニンの酸化を可変修飾として設定しました。 ペプチドおよびフラグメントの許容値は、それぞれ 10 ppm および 0.05 Da に設定されました。 タンパク質は、少なくとも 2 つの固有のペプチドで同定された場合に検証されました。 スコアが同一性しきい値より高く、偽陽性発見率が 1% 未満のイオンのみ (マスコット おとりオプション) が考慮されました。 質量分析ベースの定量は、スペクトルカウント法を使用したラベルフリー定量によって実行されました。 総 MS/MS スペクトル カウント値は、タンパク質とペプチドの閾値についてそれぞれ 95% の確率と 0.1% FDR でフィルター処理された Scaffold ソフトウェア (バージョン Scaffold 4.11.1、Proteome software Inc、ポートランド、オレゴン州) から抽出されました。 統計分析の場合、タンパク質レベルのスペクトル カウント データセットで発生する欠損値は、0.1 に固定された定数値によって補完されました。 スペクトルカウントデータセットのサンプル内変動を考慮するために、R パッケージ「ibb」（バージョン 13.06、61）を使用して計算された P 値を使用した 3 回の MS/MS 分析に基づいてベータ二項検定を実行しました。 タンパク質は、P 値 < 0.05 および倍率変化が 2 より大きい場合にフィルターされました。

質量分析プロテオミクス データは、データセット識別子 PXD040550 および 10.6019/PXD040550 で PRIDE パートナー リポジトリ経由で ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。

酸素濃度は、SP-PSt3-SA23-D3-OIW 酸素センサー スポット (PreSens GmbH、レーゲンスブルク、ドイツ) を使用して測定しました。 これらのセンサー スポットは、実験中常にスポットが浸されるように (つまり、5 mL マークより下に) シリコン接着剤で 50 mL Falcon チューブの内壁に取り付けられました。 Falcon チューブは T0 で閉じられ、実験全体を通して閉じられたままでした。

センサースポットは酸素感受性コーティングで覆われており、酸素分子が酸素透過性マトリックスに固定化された不活性金属ポルフィリン錯体の発光を消光します。 このプロセスにより、高い時間分解能と、ドリフトや酸素消費のない測定が保証されます。

センサースポット内の発光団のフォトルミネッセンス寿命は、酸素メーター (Fibox 4 トレース、PreSens GmbH) に接続されたポリマー光ファイバーを使用して測定されました。 励起光 (505 nm) はグラスファイバーによって供給され、グラスファイバーは放出された蛍光シグナル (600 nm) を酸素メーターに送り返します。 簡単に説明すると、酸素測定は、センサー スポットから光ファイバーに近づくだけで、ファルコン チューブ プラスチックを介して実現されました。 各時点で、酸素濃度は 3 回測定され、提供された結果はこれら 3 回の測定値の平均を表しています。 私たちの実験では、酸素濃度は 30 分ごとに測定されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

RNA-seq データのセット全体は GEO 申請 GSE224932 に基づいて編集され、アクセス可能です。 質量分析プロテオミクス データは、データセット識別子 PXD040550 および 10.6019/PXD040550 で PRIDE パートナー リポジトリ経由で ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。 他のすべてのデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。 ソース データは補足データ テーブルとして利用できます。

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黄色ブドウ球菌株と構築物を提供していただき、科学的な議論をしていただいた森川和也氏とTarek Msadek氏に感謝します。 また、Imagerie-Gif フローサイトメトリーおよびプロテオミクス (SICaPS) 施設 (Institute for the Integrative Biology of the Cell、I2BC、Gif sur Yvette、フランス) の支援とサポートにも感謝したいと思います。 我々はまた、France Génomique (フランス国家プログラム「Investissement d'Avenir」ANR-10-INBS-09 によって資金提供) の支援を受けた I2BC ハイスループットシーケンシング施設のシーケンシングとバイオインフォマティクスの専門知識を認めます。

この研究は、フランス国立研究庁から Nicolas Mirouze (ANR-18-CE35-0004 GenTranSa) への「若手研究者助成金」と Shi Yuan Feng に授与された中国奨学会 (CSC) 博士号助成金によって支援されました。

Shi Yuan Feng、Yolande Hauck などの著者も同様に貢献しました。

パリ・サクレー大学、CEA、CNRS、細胞統合生物学研究所 (I2BC)、91198、ギフ・シュル・イヴェット、フランス

シー・ユアン・フェン、ヨランデ・ハウク、フェディ・モルジーン、ローザ・モハメディ、ニコラス・ミロウズ

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SYF: 概念化、方法論、調査。 YH: 概念化、方法論、調査。 FM: 概念化、方法論、調査。 RM: 方法論、調査。 NM: 構想、監修、執筆 - レビューと編集、プロジェクト管理と資金調達

ニコラ・ミルーズへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: George Inglis と Tobias Goris。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Feng、SY、Hauck、Y.、Morgene、F. 他。 微好気条件下での黄色ブドウ球菌の能力の複雑な制御。 Commun Biol 6、512 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04892-1

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受信日: 2022 年 7 月 19 日

受理日: 2023 年 4 月 28 日

公開日: 2023 年 5 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04892-1

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