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Jul 19, 2023

マイクロ流体細胞培養アプリケーション向けの小型 3D プリント圧力レギュレーター (μPR)

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 10769 (2022) この記事を引用

2106 アクセス

3 引用

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

明確に定義された流体の流れは、マイクロ流体培養システムの特徴であり、細胞スケールでの生物物理学的および生化学的合図の正確な制御を可能にします。 マイクロ流体流量制御は一般に、一定流、傾斜流、パルス流などの多数の灌流オプションを提供する変位ベース (シリンジや蠕動ポンプなど) または圧力制御技術を使用して実現されます。 ただし、これらの大型フォームファクターのデバイスと付随する周辺機器を保育器やその他の限られた環境に統合するのは困難な場合があります。 さらに、マイクロ流体培養研究は主に一定の灌流条件下で実行され、より複雑な流動機能は使用されないことがよくあります。 したがって、標準的な灌流機能を提供し、培養環境に簡単に統合できる、簡素化されたフロー制御プラットフォームが必要です。 この目的を達成するために、我々は調整可能な 3D プリントマイクロ圧力レギュレーター (μPR) を導入し、マイクロ流体アプリケーションをサポートするバッテリー駆動の小型エアポンプと組み合わせることで堅牢な流量制御機能を提供できることを示します。 μPR の設計と製造について詳しく説明し、(i) マイクロ流体アプリケーションに関連する調整可能な出口圧力範囲 (1 ～ 10 kPa) を実証し、(ii) マイクロ流体ネットワークにおける動的制御機能を強調し、(iii) 人間の臍帯の維持を行います。連続灌流条件下のマルチコンパートメント培養装置内の静脈内皮細胞 (HUVEC)。 当社の 3D プリント製造アプローチとオープンアクセス設計により、幅広いマイクロ流体アプリケーションをサポートできるカスタマイズされた µPR が可能になると期待しています。

マイクロ流体アプローチは、流体の正確な操作を利用して、培養細胞の定義された生物物理学的刺激4、5、6、7、8、化合物の流入制御9、10、11、および培養環境への二次細胞集団の導入12、13。 これらのシステムでは、流体の流れの制御は通常、変位ベースまたは空気圧ポンプ方式によって実現されます14、15、16。 たとえば、シリンジ ポンプは、メカニカル ネジの回転運動を使用して、制御された流量 (Q) でシリンジ バレルから流体を吐出します。一方、蠕動ポンプは、カム機構を採用して、コンプライアント チューブを通して流体を押したり引いたりして、Q17 を直接制御します。 シリンジポンプとペリスタルティックポンプは、その堅牢な流量制御機能と標準化されたコンポーネント（シリンジ、フィッティング、チューブなど）との互換性により頻繁に使用されますが、密閉された環境に統合するのは困難な場合があります18。 さらに、スクリューまたはカム機構の機械的振動により、望ましくない流れの脈動が生じ、細胞の損傷を引き起こす可能性があります 19、20、21、22。

対照的に、空気圧ポンプ方式では、マイクロ流体ネットワーク全体で定義された圧力降下 (ΔP) を生成して Q を制御します。これらの圧力駆動の​​流れの場合、Q はハーゲン・ポアズイユ方程式 Q = ΔPR−1 によって定義され、次のように考えることができます。オームの法則と水圧の類似性。ここで、R はネットワークの形状と流体の粘度によって定義される流体抵抗です23。 空気圧システムの固有の減衰特性により、これらのアプローチは変位ベースの方法と比較して流れの脈動の影響を受けにくくなります18。 ただし、潜在的な流体抵抗の変化と付随する背圧効果のため、空気圧によるアプローチでは、多くの場合、専用の高圧空気源 (実験室用空気など)、閉ループ圧力コントローラー、背圧レギュレーターなどの複雑な周辺機器が必要になります。 、およびインライン圧力/流量センサーを使用して、所望の流量を維持します24、25、26。 したがって、空気圧法は密閉された細胞培養環境に組み込むことが難しい場合もあります27。

置換技術と空気圧技術はどちらも優れた流量制御機能を提供し、傾斜流、周期流、パルス流、さらには逆流などの流れプロファイルを動的に調整するようにプログラムできます。 ただし、これらの高度な機能は、一定の流量を使用して培養細胞を灌流またはせん断刺激する標準的なマイクロ流体アプリケーションでは使用されないことがよくあります 28,29。 一定の制御された灌流速度が実験的に普及しているため、高度な流量機能と複雑な機器を備えたソリューションよりも、シンプルでポータブルなポンプ ソリューションを優先することができます。 ポンピングプロセスを簡素化するための代替アプローチも広く検討されています。 たとえば、市販のパームトップの詰め替え可能な iPrecio 注入ポンプは、細胞を培養状態に維持するために使用されました 30。 しかし、ポンプは高価で、使い捨てであり、カスタマイズすることもできませんでした。 あるいは、静水圧や表面張力に基づく方法を含む受動的ポンピングは、低コストで使いやすいですが、長期安定性に欠けるため、マイクロ流体培養用途（24 時間以上）には適していません 31,32,33。 微小電気機械システム (MEMS) アプローチも、微細加工ポンプの作成に使用されています 34,35。 これらのマイクロポンプは、ラボオンチップアプリケーションに必要な長期制御を提供できますが、製造手順が複雑なため、カスタマイズや実装が非現実的になる可能性があります。

新興の積層造形技術である 3D プリンティングは、ラピッドプロトタイピング機能、多軸 CNC フライス加工と比較してアクセスコストが低く、射出成形と比較してツーリングコストが低いため、高度にカスタマイズされたマイクロ流体流量制御デバイスの製造方法として採用されています36,37。 、38、39。 3D プリンティングは、従来の機械加工技術や MEMS プロセスを使用して作成することが困難なフィーチャ (アンダーカット、自立フィーチャ、高アスペクト比のキャビティなど) の製造プロセスを簡素化します。 研究者らは、背圧調整器 40、Quake 型マイクロバルブ 41、および空気圧流駆動装置 26、42、43、44 用の 3D プリント部品の作成に成功しました。

シンプルだが機能的なポンプ プラットフォームのニーズに応えるために、3D プリントされたマイクロ圧力レギュレーター (μPR) を使用して、調整可能な ΔP を提供し、マイクロ流体チャネル ネットワーク内の流量を制御する空気圧ポンプ プラットフォームを紹介します。 当社の µPR は、力平衡機構を使用して、バッテリー駆動のエア ポンプによって供給される圧力を、マイクロ流体アプリケーションに関連する制御可能な圧力範囲まで下げます。 この研究では、μPR の設計と製造を詳しく説明し、動的な圧力制御と安定性の特性を確立し、膜ベースの区画化されたマイクロ流体バリア モデル内での培養の成功を実証します 45,46。 3D プリンタが研究室やコミュニティのメーカースペースで広く利用できるようになった47,48 ため、オープンアクセス設計を備えた当社の 3D プリント µPR は、どの研究室でも製造および組み立てでき、アプリケーション固有のフロー要件を達成するように調整できると予想されます。

入口（高圧）チャンバーと出口（低圧）チャンバー、および圧力制御コンポーネントを含むμPR の構造コンポーネントは、Formlabs Form 2 ステレオリソグラフィー プリンター (Formlabs Inc.、米国マサチューセッツ州サマービル) を使用して 3D プリントされました。 。 歯科用 SG 樹脂 (Formlabs Inc.、米国マサチューセッツ州サマービル) は、ガス不透過性の特性とクラス I 生体適合性 (EN-ISO 10993-1:2009/AC:2010) により、建築材料として選択されました。 3D プリントしたパーツをプリント プラットフォームから取り外し、99% イソプロピル アルコールですすぎ、加圧空気下で乾燥させ、45 °C で 45 分間 UV 硬化しました (FormCure、Formlabs Inc.、米国マサチューセッツ州サマービル)。メーカーの推奨に従って。

図 1a(i) に示すように、001 サイズの Viton フルオロエラストマー (ショア 60A) O リング (McMaster Carr、米国イリノイ州エルムハースト) を、高圧入口チャンバーのポペットバルブに隣接するコネクティングロッド上に取り付けました。 。 次に、内径 8 mm/外径 10 mm の天然ゴム (ショア 70A) O リング (McMaster Carr、米国イリノイ州エルムハースト) を入口チャンバーの外側の溝に配置しました。 図1a(ii)に示す低圧出口チャンバーは、入口チャンバーの上に配置され、コネクティングロッドがキャビティを通って延び、チャンバーを横断する空気通路を形成しました。 次に、厚さ 100 μm の Kapton (Gizmo Dorks LLC、米国カリフォルニア州テンプルシティ) を圧力感知ダイアフラムとして出口チャンバー上に配置し、コネクティング ロッドと接触させました。 図 1a(iii) に示すように、出口チャンバーの上部を密閉するために、ダイアフラムの上部に O リングが配置されました。 次に、片持ちばねを内蔵した圧力制御部品をダイヤフラム上に積層しました。 これらのカンチレバーは幅 0.5 mm、厚さ 0.5 mm、長さ 5 mm でした。 M2 ナット (McMaster Carr、米国イリノイ州エルムハースト) をエポキシ接着剤 (ClearWeld™ Professional、JB Weld Company、米国テキサス州サルファースプリングス) でカンチレバー スプリングに接着しました (図 1a(iv))。 図1(v)に示すように、ナットにM2ボルトをねじ込みました。 六角穴付きヘッドに 3D プリントされたポインターを追加してコントロールノブを作成しました。 レーザーカットされた 24 ポジションのアクリル ダイヤルを、感圧接着剤 (PSA、3M 468MP Adhesive Transfer Tape、3M Company、Maplewood、MN、USA) を使用して圧力制御コンポーネントに取り付けました。 ダイヤルは回転位置を 15° 刻みで表示します。 最後に、図 1a(vi) に示すように、3D プリントされたクランプを使用して、構造コンポーネントの間に挟まれた外側の O リングを圧縮し、組み立てを完了しました。 組み立てられたデバイスは直径 12 mm、高さ 20 mm です。 図 1b は、組み立てられたデバイスの画像をスケール用の米国の 10 セント硬貨と並べて示しています。 組み立てプロセスを示す補足ビデオ S1 を参照してください。

(a) 3D プリントされた µPR と製造ワークフローの概略図。 (i) 高圧空気入口チャンバーには、ポペットバルブ、シール用 O リング (白色)、およびコネクティングロッドが含まれています。 (ii) 低圧空気室は入口室の上部に配置されます。 (iii) カプトンダイヤフラム (黄色) と O リング (黒色) が出口チャンバーの上部に配置されます。 (iv) 圧力制御コンポーネントは 3 つの内蔵カンチレバーと 1 つのネジ付きナットで構成され、O リングの上部に配置されます。 (v) 3D プリントされた位置指示ポインターを備えた M2 ボルトがナットにねじ込まれています。 (vi) 次に、デバイスは 2 つの 3D プリントされた圧縮クランプを使用して密閉され、気密アセンブリ (Φ12 mm × 20 mm) が実現され、レーザーカットの位置ダイヤルが追加されます。 (b) 組み立てられた 3D プリントされた µPR と米国の 10 セント硬貨の隣の画像。

(ポリ)ジメチルシロキサン (PDMS、Sylgard 184、Dow Inc.、ミッドランド、ミシガン州、米国) マイクロチャネルは、標準的なソフト リソグラフィー技術を使用して製造されました 49,50。 SU-8 2100 (Karaku Advanced Materials、米国マサチューセッツ州ウェストボロー) を 4 インチのシリコン ウェーハ上にスピン コーティングし、ソフトベークし、透明マスク (オレゴン州バンドンの CAD/Arts Services Inc.) を通して UV 光に露光しました。 USA) を使用してチャネルの特徴を定義し、95 °C でポストベークします。 次いで、フォトレジストが現像された（Ｋａｙａｋｕ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、米国マサチューセッツ州ウェストボロー）。 長さ = 75 mm、幅 = 25 mm の開口領域を持つ長方形の PMMA フレームを PSA を使用してウェハーに取り付け、規定の高さの成形キャビティを作成しました。 PMMA フレームを取り付けた後、脱気した PDMS プレポリマー (塩基と触媒の質量比 10:1) をモールドに充填し、ホットプレート上で 80 °C で 1 時間硬化させました。 次に、PDMS ブロックを型から取り外し、1 mm の生検パンチ (World Precision Instruments、サラソタ、フロリダ州、米国) でアクセス ポートの穴を開けました。

3D シミュレーションは、COMSOL Multiphysics の層流物理 (定常) モジュールを使用して実行されました。 マイクロチャネル形状 (高さ 20 μm、幅 100 μm、長さ 32 cm) を、材料を水として設定して適用しました。 マイクロチャネル形状の入口に圧力 (P = 1 ～ 10 kPa) を割り当て、出口の圧力は逆流が抑制された大気圧 (P = 0) として定義されました。 ブロックの他の側には、滑りのない境界条件が割り当てられました。

一般的な実験セットアップには、μPR と PDMS マイクロ流体フロー抵抗器 (高さ 20 μm、幅 100 μm、長さ 32 cm) が備えられていました。 3 V および 0.09 A で動作する小型 DC エアポンプ SX-2 (Binaca Pumps、テメキュラ、カリフォルニア州、米国) を使用して µPR に圧力を供給しました。 μPRの出口は三方向コネクタに接続され、一端はPDMSマイクロ流体チャネルの入口に供給され、もう一端はハネウェル圧力センサー（TBPDANS005PGUCV、ハネウェルインターナショナル社、シャーロット、ノースカロライナ州、米国）に接続されました。 これらのコンポーネントの接続には、シリコン チューブ (内径 2 mm、長さ 5 cm) を使用しました。 ＰＤＭＳマイクロチャネルは、コントラストを改善するために、青色染料（米国メリーランド州ボルティモアのＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ｉｎｃ．）の脱イオン水溶液で下塗りされた。

前述の実験設定により、制御ノブの角度位置に基づいて Pout の特性評価が可能になりました。 Pout を監視しながら、制御ノブを 15 度ずつ回転させました (アクリルのダイヤルで表示)。 次に、ノブを回した後、パウトを各位置で 5 分間安定させました。 校正プロセスの全サイクルには、時計回りの回転回転 (Pout が 1 kPa から 10 kPa に増加) と反時計回りの回転 (Pout が 10 kPa から 1 kPa に減少) が含まれていました。 15 の完全なサイクルを使用して、出口圧力の読み取り値とノブの位置を校正しました。 調整された圧力の安定性を定量化するために、範囲の低、中、高の設定値をカバーする 3 つの指定圧力 (Pout = 1、5、および 10 kPa) について 1000 分間にわたってデータが収集されました。 さまざまな実験設定で新たなキャリブレーションを行う必要がないように、圧力調整器の後に大きな流体抵抗器 (20 μm × 100 μm × 32 cm) を使用することに注意することが重要です。 流体抵抗器は他の下流要素よりもはるかに大きな抵抗を提供したため、最初の校正ステップの後に再校正を必要とせずに流量センサーを取り外すことができました。 このアプローチは、電気システムの電圧降下を維持するために高入力インピーダンスを使用するのと同じです。

バリアプラットフォームの詳細な設計と製造は、以前の研究で説明されています45、46。 簡単に説明すると、細胞培養プラットフォームは、極薄のナノ膜で分離された上部と下部のマイクロチャネルで構成されていました (SiMPore Inc.、米国ニューヨーク州ロチェスター)。 ナノ膜の厚さは 100 nm、細孔サイズは 60 nm です。 このデバイスには、m-µSiM として知られるコアオープンウェルモジュールがあり、フローモジュールをウェルに追加し、磁石が埋め込まれた 2 つのハウジングを使用して磁気的にシールすることで、流体デバイスに再構成できます。 フローモジュールは標準的なソフトリソグラフィー法を使用して製造され、ハウジングはレーザーカッター (H シリーズ 20 × 12、フルスペクトラム、カリフォルニア州、米国) を使用して製造されました。 上部チャネルの寸法は、h = 200 μm、w = 1.5 mm、l = 5 mm、下部チャネルは h = 150 μm、w = 2 ～ 6 mm、l = 15 mm でした。 培地リザーバーからの流れは、チューブおよび 21 ゲージ 21 NT 分注チップ (Jensen Global、米国) を使用して上部チャネルの入口に接続されました。

使用前に、フロー回路を UV 光にさらして滅菌しました 46。 エアポンプは培養された滅菌環境内で使用されたため、排出空気をさらに濾過する必要はありませんでした。 細胞播種の前に、ナノメンブレンを 5 μg cm-2 フィブロネクチン (Corning Inc.、Corning、NY、USA) で室温で 1 時間コーティングし、その後、新鮮な細胞培地ですすいだ。 ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を、EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit ( Lonza Bioscience（米国メリーランド州ウォーカーズビル））、組織培養フラスコ内で維持されます。 使用前に、TrypLE (Thermo Fisher Scientific、米国) を使用して細胞を 3 分間解離し、150 G で 5 分間遠心分離しました。 再懸濁後、上部のマイクロチャネルを通して細胞を膜表面に播種し、1時間インキュベートして細胞の付着を促進しました。

µPR は 8 kPa (ΔP = 8 kPa) の出力圧力に設定されました。これは、上部チャネルの培地流量 1 µL min-1 (細胞単層でのせん断応力 0.02 dynes cm-2) に相当します。 24時間。 LIVE/DEAD 染色 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して、ベンダーのプロトコルに基づいて細胞生存率を評価しました。 標識細胞は、CellSens ソフ​​トウェア (オリンパス、東京、日本) を備えたオリンパス IX-81 蛍光顕微鏡を使用し、実験セット全体で一定の画像キャプチャ設定で画像化しました。

2 つの長さ 1 cm の入口チャネルと 1 cm の出口チャネルで構成される Y 字型 PDMS マイクロチャネルを、2 つの µPR (P1 および P2) と 2 つのバッテリー駆動マイクロポンプに接続しました。 各 µPR は圧力センサーに接続され、圧力を測定しました。 P1 は 1.0 kPa に維持され、P2 は変化しました。 各 P2 ステージに 30 秒の時間を与え、一連の圧力 (1.0 kPa、1.3 kPa、1.0 kPa、1.5 kPa、1.0 kPa、1.8 kPa、1.0 kPa) を提供し、合計 3 分 30 秒かかりました。 色付きの流れ間の液体-液体界面は、SMZ-168 実体顕微鏡とそのカメラ (Motic Co., ltd.、アモイ、中国) で記録されました。 データは平均値 ± 標準偏差として報告されます。

圧力調整器は一般に、高圧空気を下流の用途向けに制御可能な低い圧力設定値に下げるために空気圧回路で使用されます。 ほとんどの手動圧力レギュレーターと同様に、当社の 3D プリント µPR は力バランス機構を使用し、標準的なマイクロ流体システムに適したユーザー定義の設定値 (約 1 ～ 10 kPa) を維持するように設計されています。 μPRは図2に示すように高圧空気室、低圧空気室、圧力制御部から構成されています。 高圧空気室には、閉鎖 (底部) カンチレバー スプリング、ポペット バルブ、およびコネクティング ロッドが含まれています。 このチャンバーは小型エアポンプから一定の圧力を受けます。 圧力感知ダイヤフラムを備えた低圧チャンバーは、調整された出口圧力を出力します。 圧力制御コンポーネントは、3D プリントされた上部カンチレバー スプリングと制御ノブ (ボルトとペア ナット) で構成されており、以下で説明するように出口圧力を制御するために使用されます。 μPR の動作は、図 3 に示すように 4 つのフェーズで説明できます。

3D プリントされた µPR の重要なコンポーネントの断面図。 高圧チャンバー (赤色) には、外部源から一定の高圧空気が供給されます。 低圧チャンバー (青色) は、一定の低圧値で空気を出力します。 出口圧力は、片持ちばねと制御ノブで構成される圧力制御コンポーネントを調整することによって制御されます。

圧力調整プロセスの 4 つの段階の図。 フェーズ 1 では、空気通路が完全に閉じられ、一定の高圧源から空気が供給されます。 フェーズ 2 では、ユーザーは制御ノブを回して上部のカンチレバーを移動します。 上部カンチレバーの復元力 (FT) が増加すると、チャンバー間の空気通路は閉じたままになります。 フェーズ 3 では、FT がしきい値を超えると、空気通路が開きます。 最後に、フェーズ 4 では、低圧空気室内の圧力が制御ノブの位置によって設定された所望のレベルに達し、通路が閉じます。 ユーザーが圧力を設定すると、デバイスはフェーズ 3 とフェーズ 4 を繰り返して、希望の出力圧力を維持します。

小型エアポンプにより高圧チャンバーに一定の高圧エアが供給されます。 この段階では 2 つの閉鎖力が存在します。 入口圧力（Fin）は、ポペットに作用する入口圧力によって発生する上向きの力です。 閉じるカンチレバー スプリング力 (FC) は、調整不可能な下部カンチレバー スプリングの変位によって生成される一定の上向きの力で、組み立て中に設定されます。 これらの上向きの力によりポペットがシートに押し付けられ、チャンバー間の空気通路が閉じられます。 この段階では、ナットの下のボルトの長さは L で、ボルトの先端は下向きの力を加えることなく圧力検出ダイヤフラムに接しています。

コントロールノブを時計回りに回すと、ナットの下のボルトの長さが (L + ΔXT) に増加し、上部のカンチレバー スプリングが弛緩した状態から (ΔXT) だけ上方に変位します。 片持ちばねの上方への変位により、検出ダイヤフラムに下方への復元力 (FT = kTΔXT) が発生します。 この段階では、FT < Fin + FC であるため、空気通路は依然として上向きの力 (Fin および FC) によって密閉されます。

制御ノブをさらに回転させて ΔXT を増加させると、FT が上向きの力 (Fin + FC) に打ち勝ち、ボルトの先端が感圧ダイヤフラムとコネクティング ロッドを下方に変位させます。 コネクティングロッドの動きによりポペットバルブが外れ、空気通路が開き、高圧空気が低圧チャンバーに流入できるようになります。 低圧室内の圧力（Pout）は、感圧ダイヤフラムの下面（面積Ad）に上向きの力（Fout）を及ぼします、Pout = Fout Ad−1。

Pout は、式 1 に示すように、Fout と他の上向きの力 Fin、FC が FT に等しくなるまで増加します。 (1)。 これらの上向きの力によりポペットバルブがシートに向かって押され、チャンバー間の空気の流れが遮断されます (図 3)。 これにより、コントロールノブの回転位置を調整して上部カンチレバーのバネ力 (FT = kT ΔXT) を変更することで Pout を設定できます。 Pout は下流の流体リザーバまたはチャネルを加圧するために使用されるため、Pout が減少し、μPR がフェーズ 3 に戻り、高圧空気が圧力損失を補償できるようになります。 制御ノブによって ΔXT が設定されると、μPR はフェーズ 3 とフェーズ 4 の間を循環して、安定した設定値 Pout を維持します。

ここで、上部カンチレバーのバネ力 FT = kTΔXT; kT は上部片持ちばねのばね定数、ΔXT はばねの変位です。 出口圧力 Fout = PoutAd; Pout は出口圧力、Ad は​​感知ダイヤフラムの面積です。 Fin はポペットの露出領域にかかる入口圧力であり、FC は底部のカンチレバー スプリングからの一定の閉鎖力です。

式 (1) は、高圧チャンバー内の閉鎖カンチレバー スプリングが調整できないため簡略化されており、したがって FC は定数です。 高圧チャンバーに一定の入力圧力を供給している限り、Fin は一定です。 Fin と FC は両方とも定数であるため、ダイヤフラムに適用される FT を操作することで Fout (したがって Pout) を制御できます。 FT は上部カンチレバー スプリングの変位 (ΔXT) に比例してスケールするため、コントロール ノブの角度位置を調整することで Pout を調整できます。 補足ビデオ S2 は、圧力調整プロセスのアニメーションを示しています。

当社のポンプ プラットフォームの主な目標は、ポータブルなセットアップを維持しながら、調整可能な圧力制御を提供することです。 したがって、外部高圧源として圧縮空気ラインや加圧シリンダーの代わりに、小型のバッテリー駆動のエアポンプを選択しました。 当社の µPR は一定の入口圧力を前提として動作するため (式 (1) を参照)、小型エア ポンプからの圧力が時間の経過とともに安定していることを最初に確認しました。 ポンプは 3 V で動作し、5 日間にわたって安定した圧力 (41 ± 0.02 kPa) を維持しました。 次に、制御ノブの角度位置と、その結果として生じる出口圧力との関係を特徴づけようとしました。 図4aに示すように、制御ノブを15°ずつ回転させ（図3のΔXTの増減に対応）、出力圧力を測定しました。 データにより、2 つの異なる傾きが明らかになりました。 1 番目から 9 番目の位置 (1.0 ～ 2.2 kPa) の最初の領域では、傾きは 15 度ごとに 0.15 kPa でしたが、10 から 20 番目の位置 (2.6 ～ 10 kPa) の 2 番目の領域では、傾きは 15 度ごとに 0.70 kPa でした。 °単位で増分します。 これらの異なる傾きは、ポペットバルブのシール O リングの圧縮性の結果である可能性があります。 つまり、O リングが部分的に弁座に接触し、チャンバー (位置 1 ～ 9) 間の空気の流れを制限する可能性があります。 回転が増加すると (位置 10 から 20)、O リングがバルブシートから完全に外れ、空気がより少ない抵抗でチャンバー間を流れることができるため、より急な傾斜関係が作成されます。

(a) 出口圧力と制御ノブの位置 (15° ステップ)。 圧力は、1 番目と 9 番目の位置 (青) の間では 0.15 kPa ずつ増加し、10 番目と 20 番目の位置の間 (赤) では 0.70 kPa ずつ増加しました。 (b) (a) の校正結果に従って、制御ノブをそれぞれ 1 番目、14 番目、および 20 番目の位置に回して、圧力を 1、5、および 10 kPa に設定した出口圧力安定性テスト。 装置によって調整される出口圧力の安定性をチェックするために、圧力を 5 日間にわたって測定しました。 3 つの出口圧力は、5 日間の安定性テスト全体を通じて 1.1 ± 0.01 kPa、5.2 ± 0.11 kPa、および 10.2 ± 0.20 kPa でした。

培養用途で流れを制御するには、マイクロチャネル ネットワーク全体で安定した圧力降下 (ΔP = Pout − Patm) を提供することが重要です。 ここで、μPR によって調整される出口圧力 (Pout) は、\(\Delta P\) の確立に役立ちます。 図 4a の校正データを使用して、3 つの異なる設定値、1、5、および 10 kPa での 5 日間にわたる Pout の安定性を特徴付けました。 図 4b に示すように、出口圧力は 1.1 ± 0.01 kPa (誤差 1.1%)、5.2 ± 0.11 kPa (誤差 2.2%)、および 10.2 ± 0.20 kPa (誤差 1.9%) であり、調整可能な圧力と出力範囲全体にわたって安定した圧力を実現します。

次に、μPR を使用してマイクロ流体チャネル全体に安定した圧力降下を提供し、細胞培養アプリケーションに実用的な流量を生成する方法を検討しました。 μPR は、市販の圧力調整器では達成が困難な低流量 (例、10 ～ 100 nL min-1) をサポートするように設計されました。 図 5 では、液体の流れを制御する μPR の能力を定量化するために、さまざまな出口圧力に対する流量が測定されました。 μPR を使用して 1 ～ 8 kPa の圧力降下 ΔP を導入し、8.50 ～ 98.7 nL min−1 の範囲の流量を測定しました。 COMSOL シミュレーションと実験による流量測定 (ΔP は 1 ～ 8 kPa) の間に優れた相関関係 (R2 = 0.999) が観察されました。 関係を表す傾きは 12 nL min−1 kPa−1 です。

挿入図は、マイクロチャネル全体に ΔP を生成する圧力調整器を含むテストのセットアップを示しています。 ΔP は、μPR の出口圧力とマイクロチャネルの端の大気圧によって決まります。 ΔP (1 ～ 8 kPa) は 8.50 ～ 98.7 nL min-1 の流量をカバーし、その関係は傾き 12 nL min-1 kPa-1 で表されます。 直線は、流量と出口ゲージ圧力のシミュレーションされた応答です。 R2 = 0.999 は、実験データと COMSOL シミュレーション結果の間の相関関係です。

マイクロ流体システムでは、チャネル内のマイクロリットルスケールの培地量は代謝活性細胞によって栄養素が急速に枯渇し、細胞生存率を維持するために補充する必要があるため、培地灌流が必要です。 流体の流れを制御し、細胞を維持するためのμPRの適合性を実証するために、我々は以前に開発した組織バリアモデルに内皮単層を確立するためにμPRを使用しました46。 図6aに示すように、培養プラットフォームはナノ膜で分離された2つのマイクロチャネルで構成されています。 下部チャネルには細胞培地が充填され、上部チャネルにはμPR によって駆動される流れが供給されました。 μPR は上部培養マイクロチャネル全体で 8 kPa の安定した圧力降下を引き起こし、その結果、リザーバーから培養領域に細胞培地を導入するための一定の 1 μL min-1 流速が得られました。

(a) 細胞培養プラットフォームの概略図。 ミニ エア ポンプは高圧空気を µPR に供給し、プラットフォームの上部マイクロチャネル全体に安定した圧力降下 (ΔP) を出力します。 これにより、リザーバーからマイクロチャネルへの細胞培地の流れが生じます。 このプラットフォームは、極薄のナノ膜で分離された 2 つのマイクロチャネルで構成されています。 可逆的な磁気ラッチ機構により、プラットフォームのコンポーネントは実験後に分解できます。 培地の流れを駆動するために、µPR からの出力を 8 kPa に設定しました (Q = 1 µL min−1)。 (b) 内皮単層の断面図、および (i) 動的培養 (流動あり) と (ii) 静的培養 (流動なし) における培養細胞の比較。 細胞は LIVE/DEAD 染色で染色され、蛍光画像が緑色 (生細胞) と赤色 (死細胞) で捕捉されました。 これは、μPR が長期の細胞培養とコンフルエントな細胞単層の形成に不可欠な連続流を駆動できることを示しています。 スケールバー = 100 μm。

予想通り、μPRによって駆動される培地流を用いてデバイス内で培養された細胞は生存を維持し、24時間後にコンフルエントな単層を形成しましたが、静的コントロールの大部分の細胞は細胞培地の供給不足により死滅しました（図6b）。 生/死染色では、μPR が提供されたデバイスでは 98% の生存率が示されましたが、静的コントロール (培地流なし) では 38% の生存率でした。 これらの結果は、μPR が安定した流量を提供し、マイクロ流体デバイス内で細胞の長期培養を維持する能力を確認しました。

出口圧力は調整された制御ノブの位置に基づいて簡単に変更できるため、リアルタイムの圧力切り替えに対するμPRの応答性を実証します。 図 7 に示すように、圧力範囲全体にわたる圧力の動的ステップ変化を示します: (a) 1 kPa ～ 5 kPa ～ 1 kPa、(b) 5 kPa ～ 10 kPa ～ 5 kPa、(c) 1 kPa～10kPa～1kPa。 この実験では、この実験で使用した圧力の制御ノブ位置の設定値として、図 4a に示した校正結果を再度使用しました。 図 7 は、実験で最大の動的圧力パターンの中でも、μPR が上昇および下降して 1 分以内に目的の設定値に到達できることを示しています。

(a) 1 ～ 5 ～ 1 kPa、(b) 5 ～ 10 ～ 5 kPa、(c) 1 ～ 10 ～ 1 kPa を含む圧力パターンの動的応答は、図の校正データを使用して制御ノブを回すことによって実現されます。 4a. 各パターンには 3 つのステージがあり、各ステージでは動的圧力応答をリアルタイムで観察する 200 秒が行われます。

単一システムへの複数の µPR の統合を強調するために、2 つの µPR を利用して Y 字型マイクロ流体チャネル内の 2 つの液体の流量を個別に制御し、1 つの µPR を調整しながら二流層流界面の動的平衡位置を視覚化しました。新しい設定値に設定します。 圧力を 1.0 kPa µPR、P1 に設定して、赤色に染色した脱イオン水を Y チャネルの上部入口ポートに供給しました。 青色に染色された脱イオン水は、2 番目の µPR、P2 によって圧力が調整されて底部入口ポートに供給されました。 これらの圧力値は、実験中に 1.0 kPa から 1.8 kPa の範囲で変更されました。

予想どおり、P1 = P2 の場合、赤と青の流れの間の液液界面はチャネルの正中線 (白い破線) に位置し、複数の µPR を使用して安定した流量を供給できることが確認されました。 制御ノブを回して P2 を 1.0 kPa から 1.8 kPa に変更すると、下部チャネルの流量が増加し、界面が上に移動しました (図 8 および補足ビデオ S3 を 8 倍速で表示)。 次の一連の圧力で新しい P2 設定値ごとに 30 秒の観察時間を与えました: 1.0 kPa、1.3 kPa、1.0 kPa、1.5 kPa、1.0 kPa、1.8 kPa、1.0 kPa (合計 3)分と30秒。 液液界面は P2 圧力調整に応じて移動し、すぐに新しい位置に落ち着き、30 秒間の各圧力監視期間中安定性を維持しました。 μPR 流量調整の動的応答は、リアルタイムの圧力調整と安定した動的平衡位置を実証しました。 システムの圧力制御機能と、圧力制御を必要とするより高度なリアルタイム機能のための流量プロファイルの可能性を強調しました。

2 つの µPR で加圧された共層液体流のリアルタイム観察。 μPR #1 は層流観測チャネルの一方の入口ポートに圧力 (P1) を供給し、μPR #2 はもう一方の入口ポートに圧力 (P2) を供給します。 コントロールノブを使用して、P1 を 1 kPa に設定し、P2 を (a) 1.0 kPa、(b) 1.3 kPa、(c) 1.5 kPa、(d) 1.8 kPa に調整しました。 スケールバー = 1 mm。

当社のプラットフォームの目標は、細胞培養アプリケーションに適した安定した流れを提供しながら、ポータブルで簡素化されたマイクロ流体流量制御方法を提供することです。 空気圧制御用の市販ソリューションはありますが、これらの圧力調整器は設置面積が大きく (> 30 mm)、出口圧力範囲が高く (~ 35 kPa)、分解能が低くなります (> 3.5 kPa)。 これらのアプローチもカスタマイズできず、高価であり（前述の機能を備えたもので 100 米ドルを超える）、専用の実験室用圧縮空気ラインが必要です。 これらの手法を表 S2 にまとめます。 μPR とミニ エア ポンプを導入してマイクロ流体流量制御プラットフォームを作成することにより、ポータブル システム内でさまざまな調整可能で安定した流量を提供できます。 当社のプラットフォームは、趣味や商用の 3D プリンタの入手可能性が高まっているため、さまざまなカスタマイズの機会を備えたコスト効率の高い圧力制御スキームを提供します。 参考のために、この作業で示されているミニ エア ポンプと µPR セットアップの総コストは 7 米ドル未満であり、補足の表 S1 に示されているように、そのうち µPR は 1.20 ドル未満です。

私たちの設計 (図 2 および 3 を参照) では、圧力調整機構は従来の圧力調整器と同様です。 しかし、3D プリンティング技術を組み込むことで、市販の大型スプリングの代わりに 2 セットのカンチレバー スプリングを統合し、組み立てを簡素化し、デバイスの小型化を図ることができました。 ポペットバルブの設計に片持ちばねを組み込むことにより、図3に示すように上向きの閉鎖力（FC）を生み出し、空気通路を通って低圧室への高圧空気の漏れを防ぎます。 この「常閉」設計により、ユーザーは検査や変更のために出力圧力を遮断し、細胞培養コンパートメントを一時的に切り離すことができます。 Pout の調整はポペットバルブの閉鎖動作に依存するため、密閉性を高めるためにポペットにガス不透過性エラストマー O リング (ショア 60A) を選択しました。 これは、低圧および低流量領域で動作することが多い当社の対象アプリケーションに適しています。 1 ～ 10 kPa の範囲をターゲットにするために、24 ポジションのダイヤルを備えた制御ノブとして M2 サイズ (ピッチ 0.4 mm、直径 2 mm) のボルトを選択しました。 このような組み合わせにより、ユーザーフレンドリーな制御を維持しながら、十分な圧力分解能 (15° 回転あたり < 1 kPa) が得られます。 kT や Ad などのいくつかの主要な機械的パラメータを調整することで、さまざまな目標出口圧力範囲を達成できます。 式 (2) は、別の材料に切り替えるか、3D プリンターの硬化設定を変更することによってカンチレバーの機械的特性を変更することによって、kT を変更できることを示しています。 kT はカンチレバーの形状によっても変更できます。 たとえば、kT を下げると圧力感度を高めることができます。これは、式 1 に示すように、カンチレバー スプリングの長さを増やすか、幅または厚さを減らすことで実現できます。 (2)。

ここで、E は 3D プリントされた材料のヤング率、b、h、l はそれぞれ各カンチレバーの幅、厚さ、長さです。

kT はカンチレバーの幅 (b) よりも厚さ (h) の変化に敏感ですが (式 (2) を参照)、3D プリンターの Z 精度 (つまり、層の厚さの制御) は多くの場合、カンチレバーの幅 (b) の変化よりも低くなります。 x–y 軸が大きくなり、厚さのばらつきが大きくなります51。 たとえば、片持ちばねの厚さが 0.1 mm 変化すると (0.5 mm から 0.6 mm)、ばね定数が 70% 増加する可能性があります。 私たちは、数学的記述に基づいて、3D プリントされた µPR をさまざまな圧力範囲に適合するように修正できると予想しています。 たとえば、検出ダイヤフラム Ad の面積を増やすと、出力圧力設定値の分解能が向上しますが、デバイスの設置面積が大きくなり、出口圧力の上限 (カンチレバーの最大ばね力によって制限される) が小さくなります。はダイヤフラム面積に応じて直線的に拡大しますが、上部のカンチレバーのバネ力によって制限されます。

高気圧チャンバーと低気圧チャンバーを分離するための重要なシールコンポーネントとして O リングを使用して、3D プリントされたコンポーネントを積み重ねることによってデバイスを製造しました。 マルチマテリアル 3D プリンタを使用すると、堅固なシールを実現するための硬質部品と柔軟な部品を備えたこのデバイスを 1 つの製造ステップで印刷できますが、これらのプリンタはすべての研究室で利用できるわけではありません。 単一材料プリンタの場合、印刷-一時停止-印刷技術により、製造中にシール用の軟質材料を配置できる可能性がありますが、製造の複雑さと不確実性が増大します52。 3D プリントされた構造には、このような小さなデバイスの特徴の寸法誤差が依然として伴うため、一般的な設計ガイドラインとして機能する数式を使用して、ノブの位置と出力圧力の関係を決定するために各デバイスを校正する必要があります。 制御ノブの位置と出口圧力の関係は、一度校正されると、他の用途で目的の出口圧力を生成するために使用できます。 μPR は液体と接触しないため、必要に応じて再利用できます。 μPR ベースのマイクロ流体流量制御プラットフォームのコンパクトで簡単なセットアップにより、キャリブレーションに基づいて ΔP を手動で制御できます。 流量制御プラットフォームは必要な流量を達成するために圧力降下に依存するため、オープンエンドシステム (チャネル出口の圧力 = Patm) を使用して背圧の影響を制限しました。 細胞培養実験中、培養プラットフォームに一定の流量の培地を供給して、流さない状況と比較して HUVEC にとって生存可能な環境を維持することができました。 より複雑なマイクロ流体ネットワークまたはクローズドエンドシステムの場合、ユーザーは背圧レギュレーターを追加してマイクロ流体ネットワークの終端の下流圧力閾値を上げ、潜在的な逆流を防ぐことができますが、これには、より高い範囲の駆動圧力が必要になります。同じ流量26、53。

共層流で実証された動的制御機能により、µPR を使用した培養セットアップ変更 (細胞整列目的のせん断応力調整など) を変更することなく、出口圧力を動的に制御して異なる培地流量を導入する可能性が高まります。チャネルの形状。 シリンジ ポンプや市販の空気圧ソリューションとは対照的に、μPR ベースのシステムは設置面積が小さく、周辺機器の要件も最小限であり、細胞培養インキュベーターへの出入りが簡単です。 この研究は、単一の一定流量に対する使いやすく、調整可能でシンプルな細胞培養プラットフォームを作成することに焦点を当てていますが、パルスまたは制御されたランプフローを含む自動フロー制御機能を、ステッピングモーターとギアトレインを使用して導入して調整をプログラムすることもできます。ノブの位置に合わせます。

要約すると、製造が容易で低コストの小型 3D プリント µPR を紹介し、多くのマイクロ流体アプリケーションに関連する安定した圧力制御機能を強調しました。 また、μPR とポンピング プラットフォームを使用して、区画化された膜ベースのマイクロ流体培養環境で細胞を維持できることも実証しました。 当社のシンプルな製造技術とオープンアクセスの設計ファイルにより、他の研究室が µPR をカスタマイズして、シリンジ ポンプや従来の空気圧方式では統合が困難または不便な幅広いマイクロ流体アプリケーションをサポートできるようになると期待しています。

すべてのデータは、合理的な要求に応じて入手できます。 圧力調整器の CAD 設計ファイルは、https://abyankarlab.org から入手できます。

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この研究は、賞番号 1R43GM137651 および 1R61HL154249 の下で国立衛生研究所によって部分的に支援されました。 著者らは、イラストのサポートについては Xian Boles 氏、写真のサポートについては RIT の Nathan Tangeman 氏に感謝します。

ロチェスター工科大学電気工学部、ロチェスター、ニューヨーク州、14623、米国

スー・メンチュン & デビッド・A・借り手

ロチェスター工科大学生物医工学部、ロチェスター、ニューヨーク州、14623、米国

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MC.H.、DAB、VVA がこの作品を概念化しました。 MC.H.、MM、AA、NNNA、IMJ、SML が実験を行い、MC.H.、MM が結果を分析しました。 MC.H. そしてVVAが原稿を書きました。 著者全員が原稿をレビューしました。

ヴィナイ・V・アビヤンカールへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足ビデオ S1。

補足ビデオ S2。

補足ビデオ S3。

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転載と許可

Hsu、MC、Mansouri、M、Ahamed、NNN 他。 マイクロ流体細胞培養アプリケーション向けの小型 3D プリント圧力レギュレーター (μPR)。 Sci Rep 12、10769 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-15087-9

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受信日: 2022 年 4 月 15 日

受理日: 2022 年 6 月 17 日

公開日: 2022 年 6 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15087-9

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